Seo title

Nguyên lý cơ bản

Hệ thống điện di dung dịch sử dụng hệ đệm dung dịch thay cho môi trường rắn, những hệ thống như vậy có thể chịu ảnh hưởng bởi sự xáo trộn mẫu do có sự khuếch tán của phân tử tích điện, làm giảm độ phân giải trong quá trình ứng dụng, phân tách và các bước loại bỏ mẫu. Như vậy hệ thống điện di dung dịch phải sử dụng một vài phương tiện nhằm ổn định dung dịch trong tế bào điện di. Ví dụ: hệ thống điện di độ chênh hòa tan sử dụng các chất tan không có ion với mật độ khác nhau (Vd: Đường sucrose hoặc glycerol) để giảm thiểu độ khuếch tán của vật chất được tách ra trong quá trình điện di như Hình 1. Nhưng ngay cả có những cải tiến thì hệ thống phân tách điện di vẫn còn hạn chế đó là khi dùng cho việc chuẩn bị tỷ lệ xích vật chất (preparative scale: preparative là một từ tối nghĩa, trong công nghệ sinh học nó có nghĩa là việc cô lập vài mili gram vật chất cho việc đánh giá hoạt động sinh lý học của nó) bằng phân tách điện di.

Hình 1: Hệ thống điện di dung dịch.

Ứng dụng thiết thực nhất của phương pháp điện di trong công nghệ hóa sinh là điện di vùng (zonal electrophoresis), trong đó dung dịch ion có vai trò như một khuôn đỡ rắn và mẫu sẽ được đưa vào dưới dạng điểm hoặc băng vật chất. Giấy điện di, dải cellulose acetate, dải cellulose nitrate và gel điện di là những thành phần của hệ thống điện di (Hình 2). Những hệ thống này thông thông thường được sử dụng cho phân tích hơn là việc chuẩn bị tỷ lệ xích vật chất (preparative scale).

Hình 2: Hai hệ thống điện di vùng (zonal electrophoresis).

Tất cả các dạng của hệ thống điện di đều tuân theo quy luật như trong phương trình (*) sau đây:

(*) Độ linh động của phân tử = 

Độ linh động hoặc tốc độ chuyển động của phân tử tăng lên khi hiệu điện thế và điện tích của phân tử tăng lên và ngược lại độ linh động giảm khi ma sát giữa các phân tử hoặc độ nhớt của môi trường tăng làm cản trở dòng chảy. Tổng chuyển động thực tế của các phân tử tăng dần theo thời gian vì thế độ linh động được định nghĩa là tốc độ của sự di chuyển, phương trình (*) là phương trình cực kỳ quan trọng trong ngành hóa sinh thực nghiệm. Tất cả các hệ thống điện di đều sử dụng một hiệu điện thế bằng nhau và không đổi trên toàn bộ tiết diện cắt ngang của dải giấy, gel hay dung dịch dùng trong phân tách điện di. Đơn vị của điện trường là V/cm (độ lớn của nó được xác định bằng giá trị của điện áp), và theo định luật Ohm (V = IR) ta có điện áp V là hàm của dòng điện I và điện trở R, điện trở của hệ thống được quyết định bởi bản chất của thiết bị điện di và thành phần bộ đệm. Do đó dòng điện (vd: mA) thường được dùng để xác định yêu cầu về hiệu điện thế của phép phân tách điện di. Điện trở của hệ thống là thành phần rất quan trọng vì nó sẽ quyết định lượng nhiệt sinh ra trong quá trình điện di. Khi mà độ linh động điện di cũng phụ thuộc vào nhiệt độ do đó nhiệt độ của chất nền phân tách phải được điều khiển. Nếu một lượng nhiệt đủ lớn xuất hiện trong quá trình điện di thì yêu cầu hệ thống phải có một số thiết bị làm mát để duy trì được nhiệt độ không đổi trong suốt quá trình làm việc. Các mô hình “smiling” thường thấy trên phiến gel điện di là kết quả của sự gia nhiệt không đồng dạng của nó.

Nếu điện áp hoặc dòng điện được cấp cho hệ thống điện di là không đổi trong suốt quá trình phân tách điện di thì độ linh động của phân tử sẽ phụ thuộc vào các thành phần là dòng điện tích và tính ma sát của phân tử trong mẫu. Xét quá trình phân tách điện di trên giấy của acid glutamine, este methyl asaparagine và glycinamide tại giá trị pH 6.0. Điện tích và khối lượng phân tử của các hợp chất được mô tả trong Hình 3.

Hình 3: Phân tách bằng điện di giấy của acid glutamic, glutamine, asparagine, methyl ester và glycinamide tại pH 6.0. Glycinamide, có điện tích +1 và khối lượng phân tử là 75 có thể không nhất thiết di chuyển nhanh gấp hai lần với asparagine methyl ester có cùng điện tích nhưng có kích thước gấp hai lần. Đặc biệt, tính chất của đệm có thể ảnh hưởng đến sự phân bố độ ma sát của các phân tử nhỏ. Lực ion cao hơn có thể làm giảm sự phân bố ma sát.

Ta thấy các acid amin cùng kích thước và este methyl asparagine được phân tách tuân theo hàm về điện tích của chúng ở giá trị pH 6.0 trong khi glycinamite (có cùng điện tích nhưng kích thước chỉ bằng nửa so với este methyl asparagines) lại di chuyển xa hơn về phía cực âm (-) của hệ thống.

Nói chung các nguyên lý được minh họa trong Hình 3 có thể được sử dụng để minh họa tính linh động của phân tử ion cỡ nhỏ. Các nguyên lý này đặc biệt hữu ích cho việc tiên đoán khả năng phân tách điện di của các phân tử nhỏ chứa các nhóm có tính acid hoặc bazơ yếu, các phân tử này chỉ mang theo một phần điện tích trung bình trong dải pH liên quan đến phép chuẩn của chúng, ví dụ trong phân tách điện di của các nucleotide hoặc các acid amin.

Sự phân tách điện di của các phân tử lớn hơn các đại phân tử tuân theo nguyên lý của phương trình (*) nhưng các yếu tố khác sẽ ảnh hưởng đến độ phân giải của các đại phân tử. Độ ma sát của phân tử trong quá trình di chuyển điện di bị ảnh hưởng bởi cả hai yếu tố là hình dạng và kích thước của phân tử. Nếu quá trình điện di được thực hiện trong một môi trường có các rào cản có tác dụng cản trở đáng kể sự chuyển động của các đại phân tử thông qua nó (ví dụ như hai hệ thống thường được dùng là polyacrylamide và agarose) lúc này kích thước phân tử được chứng minh là yếu tố quan trọng nhất quyết định tính linh động của nó. Nếu tỷ lệ điện tích/khối lượng của đại phân tử được phân tách là xấp xỉ như nhau thì kích thước của phân tử là yếu tố duy nhất ảnh hưởng đến tính di động điện di. Những điều kiện này đang được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của tiểu phần protein bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có chứa natri dodecyl sunphát (SDS-PAGE), và trong phân tách điện di của các thang oligonucleotide trong quá trình giải trình tự ADN. Đối với phân tử cỡ nhỏ có các liên kết có thể xoay tự do, do đó hình dạng phân tử không ảnh hưởng nhiều đến ma sát, nên điều quyết định chính đến độ ma sát là kích thước của phân tử. Tuy nhiên các đại phân tử thường có hình dạng xác định với tỷ lệ cụ thể của các trục (ví dụ tỷ lệ chiều dài với chiều rộng) kết quả là cả hình dạng và kích thước đều ảnh hưởng tới sự di chuyển của phân tử. Phân tử có tỷ lệ lớn giữa các trục (hình dạng thuôn dài) thể hiện tính linh động trong quá trình điện di thấp hơn so với phân tử dạng hình cầu có điện tích và khối lượng bằng nhau. Ngoài ra các đại phân tử có tính linh động không giống với nguyên lý điện di từ phương trình (*) bởi vì sự tương tác của nó với các ion hoặc do sự phụ thuộc của điện tích vào sự liên kết của các nội phân tử.

 Các dạng đặc trưng của điện di thường được sử dụng trong công nghệ sinh học

– Điện di giấy ( Paper Electrophoresis)

Điện di trên giấy là phương pháp điện di thường được sử dụng để phân tích và phân giải các phân tử cỡ nhỏ. Phương pháp này không được sử dụng để phân giải các đại phân tử (ví dụ protein…) bởi vì sự hấp thụ và sức căng bề mặt liên kết với giấy điện di thường làm thay đổi hoặc biến tính các đại phân tử tạo ra độ phân giải kém.

Có hai phương pháp điện di giấy.

Đối với quy trình khô, mẫu của chất tan được hòa tan trong nước hoặc một bộ đệm dễ bay hơi sau đó nó được nhỏ một giọt nhỏ hoặc sọc mỏng lên đường gốc (origin line) hoặc đường chì (pencil line) trên giấy, sau đó các hợp chất tiêu chuẩn thích hợp đã biết được đưa vào các vị trí khác trên đường gốc của giấy. Nếu bạn dự đoán được rằng sự di chuyển điện di sẽ về cả hai phía điện cực của hệ thống thì đường gốc nên được đặt tại tâm của giấy, còn nếu sự di chuyển điện di chỉ theo một hướng điện cực thì đường gốc nên được đặt tại gần một đầu (rìa) của giấy. Sau khi dung môi hòa tan có chứa các mẫu đã bay hơi hết, giấy được làm ẩm với đệm điện di bằng cách phun đồng nhất hoặc ngâm thấm các đầu của tờ giấy để làm ẩm cả 2 đầu và đường gốc của nó.

Quy trình ướt, mẫu dung dịch cô đặc trong nước cất được nhỏ lên trên giấy trước khi được làm ẩm với đệm điện di. Quy trình khô có lợi thế so với quy trình ướt đó là cho phép điểm mẫu ban đầu nhỏ và độ phân giải tốt hơn đối với những hợp chất có cùng độ linh động. Tuy nhiên quy trình khô khá bất tiện bởi vì việc nhúng và phun đòi hỏi kỹ năng thao tác để ngăn việc làm dây mẫu ra ngoài. Quy trình ướt đơn giản hơn nhiều nhưng giọt mẫu điểm thường lớn hơn và độ phân giải thu được kém hơn do sự khuếch tán của mẫu.
Sau khi mẫu được đặt lên mảnh giấy ẩm, giấy này được đưa vào buồng điện di để cho cả hai đầu của giấy đều tiếp xúc với bình chứa bộ đệm điện di và các điện cực (Hình 4). Nếu đường gốc không nằm tại tâm của tờ giấy thì tờ giấy phải được định vị sao cho có thể cho phép tối đa sự di chuyển về phía điện cực mong muốn. Sau đó buồng điện di được đóng lại để ngăn sốc điện và điện trường sẽ được cấp cho hệ thống.

Dưới tác dụng của điện trường và điện trở lên dòng điện, bộ đệm giấy sinh ra nhiệt, đây là vấn đề lớn và khó khăn nhất đối với phương pháp điện di trên giấy bởi vì nhiệt sinh ra có tác dụng sấy khô giấy làm cản trở dòng điện và kết quả làm cho điện trở lại tăng lên v.v. Kể cả nếu ta có thể ngăn chặn quá trình bị sấy khô của giấy bởi nhiệt thì lượng nhiệt sinh ra này vẫn làm thay đổi tính chất dòng điện và trở kháng của hệ thống làm biến dạng sự di chuyển của phân tử.

Hình 4: Hai hệ thống điện di giấy.

Bởi vì những khó khăn trên nên các hệ thống điện di trên giấy hiện đại đã được thiết kế để khắc phục những vấn đề về nhiệt lượng sinh ra. Hầu hết các thiết bị sử dụng điện áp thấp được thiết kế dưới dạng nhỏ gọn cơ động và nó có thể được vận hành trong phòng lạnh hoặc trong buồng đông lạnh. Ngược lại các thiết bị sử dụng điện áp cao thường sử dụng hệ thống làm mát dạng giường phẳng hoặc được vận hành trong một bồn làm mát chứa dung môi trơ và không phân cực (ví dụ: Varso-một sản phẩm từ chưng cất dầu mỏ). Dung dịch này hấp thụ nhiệt tỏa ra từ hệ thống mà không cần trộn với nước, bộ đệm hoặc các mẫu trên giấy (Hình 4). Sau khi điện di các mẫu trên giấy với thời gian và điện áp yêu cầu cho sự phân tách tối ưu, dòng điện sẽ được ngắt, giấy được lấy ra khỏi hệ thống và được sấy khô sau đó ta có thể xác định được sự hiện diện và vị trí của các phân tử cần quan tâm.

– Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis):

Đây là một phương pháp mới cho sự phân tích điện di và có ứng dụng ngày càng nhiều trong nghiên cứu sinh hóa.

Tên của phương pháp đã giúp ta phần nào đoán được nguyên lý hoạt động của nó, trong đó vật chất được phân tích và môi trường điện di được đặt trong một ống mao dẫn mịn, dài (thông thường dài từ 50 đến 100cm và đường kính trong từ 15 đến 100 μm). Một lượng mẫu rất nhỏ (cỡ nano lít) được đặt tại một đầu của ống mao dẫn và chịu sự điện di dưới trường tạo bởi điện áp từ 20 đến 30kV. Chất phân tích sẽ được phân tách tuân theo nguyên lý của phương trình (*) và được phát hiện khi chúng xuất hiện ở đều bên kia của ống mao dẫn thông thường là bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao. Ưu điểm của điện di mao dẫn là nó cho độ phân giải cực cao, tốc độ và độ nhạy cao đối với việc phân tích các mẫu rất nhỏ nhưng rõ ràng nó không thực sự hữu ích trong phương pháp chuẩn bị vật liệu (preparative). Nó thường sử dụng trong việc phân tách các phân tử ADN có kích thước khác nhau chỉ một nucleotit đơn lẻ. Bởi vì phương pháp điện di mao dẫn có độ phân giải rất cao, nên nó là cơ sở để phân tách các polynucleotide trong trình tự ADN kiểu mới. Phương pháp điện di mao dẫn cũng phù hợp với sự phân tách các phân tử không tích điện bằng cách thêm các vi hạt tích điện vào trong môi trường dung dịch điện di. Nếu hỗn hợp dung dịch hòa tan được ngăn cách giữa môi trường nước và phần kỵ nước bên trong của vi hạt được đưa vào trong hệ thống này thì chúng có thể được phân tách bằng phương pháp điện di. Điện di mao dẫn là một phương pháp có tính linh động cao, phạm vi ứng dụng và phương pháp tối ưu hóa cho nó vẫn đang được nghiên cứu.

Điện di trên gel ( Gel Electrophoresis)

Đối với phương pháp điện di trên gel, phân tử được phân tách trong hệ đệm lỏng được hỗ trợ trong một chất nền polime. Hệ thống điện di trên gel có một số ưu điểm rõ rệt. Đầu tiên, chúng có thể thích hợp trên những mẫu lớn hơn so với hầu hết các hệ thống điện di giấy, và cũng có thể sử dụng cho việc chuẩn bị tỷ lệ xích (preparative scale) cho các đại phân tử. Thứ hai là tính chất của chất nền gel có thể thay đổi theo ý muốn để phù hợp với những ứng dụng cụ thể, bởi vì gel làm tăng độ ma sát và điều chỉnh sự linh động điện di (xem phương trình (*)). Vật liệu để làm chất nền có nồng độ thấp hoặc mức độ thấp các liên kết chéo của các monomer trong hệ thống gel có thể được sử dụng rộng rãi như một thiết bị ổn định hoặc loại bỏ đối lưu với sự cản trở tương đối thấp của ma sát lên sự chuyển động của các đại phân tử. Vật liệu có nồng độ cao hoặc mật độ các liên kết chéo của các monomer lớn được sử dụng để tạo ma sát dùng trong việc sàng lọc phân tử. Sàng lọc phân tử là tình huống trong đó độ linh động điện di và sự di chuyển của dung dịch được xác định chủ yếu thông qua độ nhớt và kích thước lỗ rỗng, kết quả là sự di chuyển của các đại phân tử trong hệ thống sẽ cơ bản được xác định bởi khối lượng phân tử của chúng.

Rất nhiều tác nhân dạng gel đã được sử dụng trong hệ thống điện di, trong đó gel agarose (polymer polygalactose) được sử dụng khá phổ biến, đặc biệt là trong ứng dụng với những đa phân tử như acid nucleic, lipoprotein v.v. Gel polyacrylamide là một trong những tác nhân hữu ích và linh hoạt nhất sử dụng trong phân tách điện di bởi vì nó dễ dàng giải quyết một loạt các protein và acid nucleic.

Gel polyacrylamide được hình thành từ quá trình polymer hóa acryamide (đơn phân tử) và N,N&-methylene-bis-acrylamide (liên kết chéo) (Hình 5).

Hình 5: Cấu hình gel polyacrylamide.

Acrylamide đơn phân tử và dạng liên kết chéo tự bản thân nó tồn tại ở trạng thái bền hoặc được trộn ở trong dung dịch, nhưng polymer dễ dàng xuất hiện trong hệ thống tạo gốc tự do. Các nhà hóa sinh sử dụng các nguồn gốc tự do hóa học hoặc hóa quang để tạo ra quá trình polymer hóa. Đối với phương pháp hóa học (phương pháp được sử dụng phổ biến nhất) chất khởi tạo gốc tự do là amoni persulfate (APS) được thêm vào cùng với chất xúc tác N,N,N&,N&-tetramethylethylenediamine (TEMED). Hai thành phần nêu trên cùng với đơn phân tử, thành phần liên kết chéo và hệ đệm phù hợp sẽ tạo thành gốc tự do thích hợp để tạo ra sự polymer hóa. Đối với quá trình quang hóa (ít được sử dụng hơn), amoni persulfate được thay thế bởi thành phần nhạy ánh sáng (ví dụ riboflavin) để tạo ra gốc tự do khi nó bị chiếu bằng tia cực tím. Có thể thay đổi để tạo ra loại gel sử dụng phù hợp với từng ứng dụng. Nếu ứng dụng yêu cầu lỗ có kích thước lớn bạn có thể giảm lượng đơn phân tử hoặc (và) liên kết chéo trong dung dịch, ngược lại có thể tăng nồng độ của đơn phân tử hoặc liên kết chéo (hoặc cả hai) để giảm kích thước lỗ.

Yêu cầu về kích thước lỗ cho từng quá trình phân tách điện di cụ thể sẽ phụ thuộc vào kích cỡ khác nhau của hợp chất mà bạn sẽ xử lý. Ví dụ, nếu bạn muốn xử lý hai protein cỡ nhỏ có kích thước 8000 Da và 6000 Da thì bạn cần phải có loại gel với kích thước lỗ nhỏ (15 đến 20% acrylamide) nhưng loại gel này sẽ không cho độ phân giải đối với hai protein lớn hơn với kích thước 150000 Da và 130000 Da, trong trường hợp này ta phải sử dụng loại gel có kích thước lỗ lớn hơn (với nồng độ acrylamide từ 7.5 đến 10%).

• Điện di trên gel polyacrylamide – Natri dodecyl sulfate (SDS-PAGE).

Hệ thống điện di trên gel natri dodecyl sulfate (Sodium Dodecyl Sulfate – SDS) được sử dụng để xác định số lượng và kích thước của chuỗi protein hoặc các chuổi tiểu đơn vị protein trong việc phân tách protein. Ban đầu quá trình chuẩn bị protein được xử lý với một lượng dư thiol hòa tan (thường là 2-mercaptoethanol) và SDS. Dưới những điều kiện này, thiol làm giảm tất cả các liên kết disulfide (-S-S-) có mặt bên trong hoặc ở giữa các đơn vị peptide, trong khi SDS (chất tẩy rửa ion hoặc biến tính) liên kết với tất cả các khu vực của protein và phá vỡ hầu hết các liên kết không phải liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử và tương tác của nội phân tử protein. Hai thành phần này dẫn đến kết quả là toàn bộ protein trong mẫu bị biến tính, tháo cuộn và tính anion cao (điện tích âm) của chuỗi polypeptide

Chuỗi anion polypeptide sau đó được điện di trong gel polyacrylamide bão hòa với SDS và hệ đệm mang dòng thích hợp. SDS dư thừa được đưa vào trong gel nhằm duy trì trạng thái biến tính của protein trong quá trình phân tách điện di. Polypeptide được phủ SDS (xấp xỉ 1 phân tử SDS trên 2 acid amino) tạo ra tỷ lệ điện tích trên khối lượng xấp xỉ như nhau cho tất cả các protein. Tại thời điểm này, điện tích nội tại trong chuỗi polypeptide riêng lẻ (có nghĩa là không có mặt SDS) là không đáng kể so với điện tích âm của chúng khi có mặt SDS. Ma sát xuất hiện khi các phân tử di chuyển qua đệm polyacrylamide, bây giờ sẽ là yếu tố chính ảnh hưởng đến độ linh động của phân tử. Ngoài ra sự ma sát của các phân tử trong quá trình phân tách cũng bị chi phối bởi kích thước lỗ rỗng của ma trận polyacrylamide, polypeptide lớn sẽ chịu ma sát lớn hơn các polypeptide nhỏ khi đi qua ma trận polyacrylamide với kích thước đã xác định (các polypeptide cỡ nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn loại cỡ lớn). Tóm lại điện di SDS-PAGE cho phép phân tách protein dựa theo kích thước của chúng.

Nguyên tắc cơ bản của dạng SDS-PAGE thông dụng nhất được minh họa bằng cách mô tả từng bước sự di chuyển của protein trong gel. Quan sát trong hình 2, SDS-PAGE sử dụng hai hệ đệm/ các thành phần gel polyacrylamide trong một phiến duy nhất, được gọi là gel cô “stacking gel” và gel tách (hoặc gel phân giải) “running (resolving) gel”. Mẫu protein đầu tiên được đưa vào giếng đã cho gel cô sau khi chúng được trộn với bộ đệm nhớt (30% glycerol) có chứa SDS và thiod. Sau khi mẫu đã được nạp, điện áp sẽ được cấp cho hệ thống (với dòng đi qua gel cỡ 3 đến 4 V/cm2) giữa hai bể phân tách của đệm glycine với pH 8.3.

Cụ thể là giá trị điện tích lớn sẽ làm tăng tính linh động, trong khi đó kích thước lớn sẽ làm tăng độ ma sát và làm giảm tính linh động. Glycine có điện tích trung bình vào khoảng -0.1 tính cho một phân tử tại pH 8.3 (đệm tách/ đệm glycine) và hầu như không có điện tích âm tại pH 6.8 (pH gel cô). Ngược lại protein được phủ SDS trong hệ thống sẽ mang điện tích âm cao đó là bản chất độc lập của pH trong hệ thống. Tại nồng độ pH yếu trong gel cô, anion glycine bị mất điện tích âm và độ linh động của nó sẽ bị giảm xuống. Ngược lại, ion clorua di chuyển nhanh, sẽ chạy trước các protein vì nó có kích thước nhỏ (ma sát thấp) và có đủ điện tích âm (không bị mất như trường hợp trên). Các protein tích điện âm trong hệ thống có hệ số ma sát lớn do đó chúng di chuyển chậm hơn so với clorua nhưng nhanh hơn các anion glycine gần như không tích điện. Kết quả của độ linh động của các anion này làm cho protein được tích lũy ở phần trước của glycine (Hình 2-b) và sau đó được dồn tập trung tạo thành các băng hẹp tại ranh giới của gel cô và gel tách (Hình 2-c), trong khi đó ion clorua nhanh chóng di chuyển từ trong gel cô vào gel tách.

Khi các anion đi vào trong gel cô thì nồng độ cao của hệ đệm pH 8.8 và nồng độ cao của acrylamide (làm giảm kích thước lỗ) trong gel sẽ kích hoạt hai quá trình. Đầu tiên là nồng độ pH cao của hệ đệm sẽ truyền điện tích âm cho các ion glycine (các ion này di chuyển rất chậm trong hệ đệm pH 6.8 trong gel cô), vì chúng có khối lượng nhỏ và giờ đây điện tích đã được tăng lên nên các anion glycine nhanh chóng bắt kịp các protein cũng đang chuyển động trong hệ thống. Tỷ lệ điện tích trên khối lượng trở nên bằng nhau trên các protein do sự xuất hiện của SDS trong hệ thống (xem phần trên) do đó sự di chuyển của các protein lúc này sẽ chỉ phụ thuộc vào kích thước của chúng.

Có hai phương pháp quan hóa thông dụng nhất thường được sử dụng để quan sát sự phân tách của protein trong SDS-PAGE. Sự lựa chọn giữa hai phương pháp chủ yếu dựa vào độ nhạy được yêu cầu trong ứng dụng. Phương pháp thứ nhất liên quan đến việc làm bão hòa gel trong dung dịch acid axetic, methanol và nước có chứa thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250. Methanol và acid axetic trong dung dịch có tác dụng cố định protein trong chất nền gel còn Coomassie Brilliant Blue liên kết với các protein trong gel. Tương tác giữa thuốc nhuộm Coomassive và protein chủ yếu thông qua lượng dư của arginine mặc dù các tương tác yếu với tryptophan, tyrosine, phenylalanine, histidine và lysine cũng liên quan đến quá trình này. Tiếp đó gel sẽ bị làm mất màu với một dung dịch acid axetic/dung dịch methanol không có chứa thuốc nhuộm (để loại bỏ thuốc nhuộm từ các phần không chứa protein của gel), protein lúc này xuất hiện dưới dạng một băng màu xanh đậm trên gel polyacrylamide. Khi được thực hiên đúng cách phương pháp này đủ nhạy để phát hiện băng protein chỉ bao gồm một lựơng polypeptide rất nhỏ cỡ 0.1 đến 0.5%g. Một phương pháp nhuộm khác là nhuộm bạc, đây là phương pháp có độ nhạy cao, có thể phát hiện 10 ng protein có trong một băng gel crylamide đơn. Nhuộm bạc được bắt đầu cách làm bão hòa gel với dung dịch bạc nitrat, tiếp theo một chất khử sẽ được thêm vào để làm giảm ion Ag+ và kết tủa thành kim loại bạc trên protein trong gel và làm cho các băng protein màu đen xuất hiện trên gel. Nhuộm bạc là một kỹ thuật rất khó do đó nó chỉ được thực hiện khi hiển thị với độ nhạy cực cao.

Đẳng điện hội tụ (Isoelectric Focussing) Đẳng điện hội tụ là một kỹ thuật điện di dùng để phân tách các đại phân tử dựa trên các điểm đẳng điện của nó (các giá trị pI, pH mà tại đó chúng không mang điện tích). Đối với SDS-PAGE quá trình này có thể được thực hiện trong dạng phiến, độ chênh pH được thiết lập trong gel polyacrylamide với sự hỗ trợ của ampholytes là một loại polymer cỡ nhỏ (~5000 Da) có chứa phân bố ngẫu nhiên của các nhóm acid và bazơ yếu (vd, carboxyl, imidazole, amin v.v) Gel polyacrylamide bao gồm những ampholyte này được đưa vào một thiết bị điện di có chứa dung dịch acid loãng (H+) ở anode và bazơ loãng (OH–) ở cathode trong buồng điện di.

Khi điện áp được cấp cho hệ thống, dòng điện chủ yếu sinh ra do sự di chuyển của các loại ampholyte tích điện xuất hiện ở trong gel. Các ampholyte di chuyển về phía hai cực phù hợp với phân bố điện tích của chúng; các ampholyte với điểm đẳng điện thấp hơn (vd, các loại bao gồm số lượng lớn các nhóm carboxyl và có điện tích âm) sẽ di chuyển về phía anode, trong khi các ampholyte có điểm đẳng điện cao hơn (vd, các ampholyte có nhiều các nhóm amin hơn và có điện tích dương) sẽ di chuyển về phía cathode. Cuối cùng, mỗi ampholyte trong hệ thống sẽ tới vị trí có giá trị pH bằng với điểm đẳng điện của nó trong gel. Khi điều này xảy ra các ampholye lúc này sẽ không có điện tích và chúng không thể tiếp tục di chuyển trong gel. Kết quả của quá trình này là sau một khoảng thời gian điện di thích hợp nồng độ của ampholyte sẽ có vai trò như một hệ đệm cục bộ để thiết lập độ chênh pH ổn định trong gel polyacrylamide. Độ chênh pH này chính là cơ sở để phân tách đại phân tử có sẵn trong hệ thống (hoặc được đưa vào hệ thống sau đó).

Protein ở trong hệ thống hoạt động giống với các ampholyte ở chỗ sự di chuyển phụ thuộc vào điện tích của chúng. Khi các ampholyte thiết lập độ chênh pH trong gel thì các protein trong hệ thống cũng bắt đầu di chuyển về các cực tương ứng đến khi giá trị pH của chúng bằng giá trị pH trong gel, tại đây chúng không mang điện tích âm nữa (pI của protein). Tại điểm này lực tác dụng lên protein gây bởi anode và cathode có giá trị bằng nhau và protein không còn khả năng di chuyển trong hệ thống. Trong thực tế các loại protein khác nhau trong gel sẽ hội tụ tại các vị trí cụ thể trong gel thỏa mãn điều khiện giá trị pH tại ví trí đó bằng giá trị pI của chúng.

Vậy, làm thế nào để xác định quá trình phân tách điện di đã hoàn thành hay chưa? Như đã nói ở trên, quá trình phân tách kết thúc khi giá trị pI của ampholyte và protein đạt tới giá trị pH trong gel khi đó chúng không thể di chuyển được nữa. Khi protein và ampholyte không còn di chuyển thì dòng điện trong hệ thống sẽ giảm xuống một cách đáng kể. Điện di đẳng điện hội tụ được thực hiện với sự có mặt của ampholyte với nồng độ rất thấp (2-4%), nên điện áp cao (150V/cm2) có thể được cấp cho hệ thống mà không sinh ra lượng nhiệt vượt quá mức cho phép (lượng nhiệt sinh ra do dòng lớn). Vì phương pháp này được thiết kế để phân tách protein dựa trên nguyên tắc điểm đẳng điện nên ta phải chú ý tới một vấn đề đó là hệ số ma sát trong việc phân tách các đại phân tử, nói cách khác kích thước lỗ của gel phải đủ lớn để sao chỗ các đại phân tử có thể di chuyển tự do tới vị trí điểm đẳng điện của chúng. Nếu kích thước lỗ của chất nền giới hạn tốc độ di chuyển của các protein có khối lượng phân tử lớn thì điểm đẳng điện sẽ ảnh hưởng nhiều hơn tới quá trình phân tách. Khi gel polycrylamide được sử dụng trong quá trình này thì nồng độ acrylamide trong gel không được vượt quá 8%. Nếu muốn bạn có thể thực hiện điện di đẳng điện hội tụ bằng cách sử dụng phiến chất nền với vật liệu khác ví dụ agarose hoặc chất nền dạng lỏng trong đó có sử dụng độ chênh lệch mật độ sucrose làm tác nhân khử đối lưu. Trên thị trường có sẵn ampholte với rất nhiều dải pH khác nhau phục vụ cho việc phân tách các phân tử theo yêu cầu (vd, pH 3-5, pH 2-10, pH 7-9…). Trước đây, điện di hội tụ đẳng điện thực hiện trong dạng phiến đã được sử dụng rộng rãi chỉ như một kỹ thuật phân tích. Gần đây thì hệ thống điện di hội tụ đẳng điện đã được cải tiến cho phép nó có thể được sử dụng trong việc chuẩn bị vật liệu (preparative) với tỷ lệ xích lớn và không biến tính bằng cách sử dụng môi trường điện di là chất lỏng có tác nhân khử đối lưu thay cho việc sử dụng phiến gel.

• Điện di trên gel Agarose

Điện di trên gel agarose là kỹ thuật được sử dụng để xác định kích thước của acid nucleic có khối lượng phân tử cao (ADN và ARN). Agarose là chuỗi polymer mạch thẳng được cấu tạo bởi galactose và 3,6-galactose khan (anhydrogalactose) được liên kết thông qua liên kết glycosidic, agarose được tách chiết từ tảo biển. Polyme agarose có thể chứa tới 100 đơn vị monomer, với khối lượng phân tử trung bình vào khoảng 10000 Da. Agarose được đúc bằng cách hòa tan bột agarose trắng trong dung dịch đệm có chứa EDTA và Tris-acetate hoặc Tris-borate (hệ đệm TAE hoặc TBE tương ứng). Khi hỗn hợp được gia nhiệt tới gần nhiệt độ sôi thì bột agarose hòa tan trong đệm tạo thành một dung dịch trong suốt. Sau đó dung dịch được làm làm mát tới nhiệt độ phòng, liên kết hydro trong và giữa các đơn vị polygalactose trong dung dịch sẽ hình thành nên loại gel rắn với kích thước lỗ tương đối đồng nhất. Quá trình polyme hóa này không liên quan đến các phản ứng hoá học, không giống như quá trình xảy ra đối với gel polyacrylamide đã mô tả bên trên.

Cũng giống như đối với gel polyacrylamide, kích thước lỗ của gel agarose cũng có thể được kiểm soát bằng cách thay đổi phần trăm của agarose hòa tan trong dung dịch. Với phần trăm agarose cao (3% wt/wt) sẽ thu được gel có kích thước lỗ lớn hơn loại có nồng độ thấp hơn (0.8% wt/wt). Phần trăm của agarose sẽ quyết định kích thước của các phân tử khác nhau có thể được xử lý trong quá trình điện di; gel có nồng độ agarose cao (kích thước lỗ nhỏ) có thể phân tách phân tử có khối lượng nhỏ hơn trong khi gel có nồng độ agarose thấp sẽ phân tách được phân tử có khối lượng lớn hơn. Phạm vi phân tách hiệu quả của gel agarose với nồng độ agarose khác nhau.

Sau khi dung dịch được đun nóng để hòa tan agarose chúng sẽ được làm lạnh ngay tức khắc và và được đổ vào khuôn dạng phiến bịt kín một đầu cùng với Teflon hoặc hoặc lược nhựa. Sau khi quá trình polymer hóa dung dịch kết thúc lược nhựa sẽ được lấy ra khỏi gel để lại các lỗ gọi là các giếng, và mẫu ADN hoặc ARN sẽ được tra vào các giếng đó. Gel sau đó sẽ được đưa vào buồng điện di và được để hoàn toàn trong đệm TAE hoặc TBE (các đệm được sử dụng để đúc gel). Tiếp theo mẫu acid nucleic sẽ được trộn với một hệ đệm nhớt (chứa 30% glycerol) có chứa thuốc nhuộm đánh dấu dùng để theo dõi quá trình điện di. Chất đánh dấu Bromphenol màu xanh sẽ di chuyển bằng vận tốc di chuyển của 1 phân tử ADN khoảng 500 bp, trong khi xylene cyanole sẽ di chuyển với vận tốc của một phân tử ADN 4000 bp.

Các mẫu acid nucleic được đưa vào các giếng của gel, mẫu ADN đã biết trước khối lượng phân tử (số bp) cũng được đưa vào một trong các giếng đó. Mẫu chuẩn này được sử dụng để xác định kích thước của mẫu acid nucleic chưa biết sau khi kết thúc quá trình phân tách điện di (xem bên dưới). Nhớ rằng ADN tích điện âm, do đó cathode (điện cực âm) nên được đặt ở phía gần với khu vực giếng đặt mẫu trong khi anode (điện cực dương) nên được đặt tại vị trí đối diện. Điện áp có giá trị khoảng 4 đến 6 V/m sẽ được cấp cho hệ thống (tạo ra dòng (50-70mA), quá trình điện di sẽ tiếp diễn tới khi chất đánh dấu màu xanh bromophenol chạm tới một đầu của gel. Cần phải chú ý rằng điện di trên gel agarose không giống với SDS-PAGE ở chỗ là nó không sử dụng gel cô (stacking gel). Vì acid nucleic trong mẫu có ma sát trên gel lớn hơn so với ma sát trên hệ đệm có trong giếng, do đó chúng nhanh chóng tập trung tại mặt tiếp giáp giữa gel và bộ đệm trước khi đi vào trong chất nền.

Làm thế nào để quan sát các acid nucleic sau quá trình điện di? Ethidium bromide là một chất nhuộm huỳnh quang có khả năng xen vào giữa các bazơ acid nucleic xếp song song (ví dụ, ADN xoắn kép). Kết thúc quá trình điện di, gel được đặt trong dung dịch đệm TBE hoặc TAE có chứa ethidium bromide để chất này khuếch tán vào trong gel và liên kết với các acid nucleic. Tiếp theo là quá trình tẩy nhuộm ngắn trong đệm không chứa ethidium bromide (để loại bỏ ethidium bromide khỏi bề mặt của gel ở những nơi mà không có acid nucleic), sau đó gel được soi dưới ánh sáng tia cực tím (UV – có bước sóng 256-300 nm) làm lộ ra các đoạn acid nucleic có băng huỳnh quang màu cam hoặc hồng trên gel. Các băng huỳnh quang này được ghi lại bằng việc chụp ảnh gel trong một buồng tối trong khi gel được chiếu án sang UV. Sử dụng một bộ lọc để lọc các tia cực tím do đó hầu hết aánh sáng chiếu lên phim là từ ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các băng acid nucleic chứa các liên kết với edithium bromide.

Phương pháp để xác định khối lượng phân tử của một acid nucleic chưa biết hoàn toàn giống với phương pháp xác định khối lượng phân tử protein trong SDS-PAGE. Đồ thị hàm log của khối lượng phân tử acid nucleic với kích thước đã biết so với độ linh động tương đối của chúng được xây dựng sẵn như một hàm chuẩn, từ đó với độ linh động tương đối trong cùng một loại gel của các đoạn acid nucleic chưa biết ta có thể xác định được khối lượng phân tử và số lượng cặp bazơ một cách dễ dàng dựa vào đường chuẩn (một bazơ đơn lẻ có khối lượng trung bình xấp xỉ 320 Da còn một cặp bazơ đơn lẻ có khối lượng phân tử cỡ 640 Da).

Tài liệu tham khảo:
Biomedia.vn dịch lược
Robert L. Switzer, Liam F. Garrity (1999), Experimental Biochemistry third edition, ISBN-13: 978-0716733003, New York.